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(GB/T 17817-2010、GB/T 17818-2010、GB/T 17812-2008)饲料中 18种氨基酸的测定(柱前衍生HPLC法)

应用简介

(GB/T 17817-2010、GB/T 17818-2010、GB/T 17812-2008)饲料中 18种氨基酸的测定(柱前衍生HPLC法)——应用编号:AF10023

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氨基酸对动物的生长、神经系统的发育及动物体内营养物质的正常代谢都有重要的作用,而且蛋白质是动物生长必需的营养物质,是评价饲料营养成分的一种重要物质,而氨基酸是构成蛋白质的基本单位,所以氨基酸的种类和含量也就是评价饲料质量的根本依据,从而准确检测氨基酸的含量和种类具有重要意义。柱后衍生的方法,虽然准确性高,但是耗时长、灵敏度低,所以本文采用柱前衍生的方法以缩短分析时间,增加灵敏度。同时该方法得到的氨基酸衍生物在-20℃可保存数月,克服了柱前衍生法衍生物不稳定的缺点,另外该方法准确性高,用标准品做未知样品进行检测,检测的含量与标准品的标示值非常接近。

(1) 样品前处理

酸水解法:准确称取一定量的样品,使样品氨基酸总量在50~75mg范围内,置于20~30mL安瓿瓶中,加入10mL含0.1%苯酚的6mol/L盐酸,振摇使样品溶解或者是样品均匀分散在溶液中,将安瓿瓶置于-20℃冰箱中冷冻3~5分钟,充氮后用喷灯熔封,然后置于110±1℃烘箱中水解24小时,取出冷却,取水溶液1mL,置于浓缩管中用浓缩仪浓缩至干,加入1mL的0.1mol/L稀盐酸溶解,用0.45μm滤器过滤后,取清液贮存于冰箱中,供衍生使用。

(2) 衍生方法

准确量取水解后溶液及氨基酸标准品200μL,分别置于1.5mL离心管中,往每支离心管中准确加入正亮氨酸内标50μL,然后分别加入三乙胺乙腈溶液100μL和异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μL,摇匀室温静置衍生1小时。衍生结束后分别加入400μL正己烷,振摇并静置10min,取下层溶液200μL并用水稀释到1mL,混合均匀后用0.45μm针式过滤器过滤即可。

(3) 检测方法

3.1 溶液配制

流动相A:称取15.2g无水乙酸钠,加水1850mL,溶解后用冰醋酸调pH值到6.5,然后加乙腈溶液140mL,混合均匀并用0.45μm滤器过滤流动相B:80%乙腈水溶液

3.2 高效液相检测条件

仪器:LC-10F 高效液相色谱仪

色谱柱:Venusil AA氨基酸分析专用柱4.6×250mm,5μm,100Å

流 速:1mL/min;进样量:10μL

检测波长:254nm;柱 温:40℃

检测梯度如表1

时间

流动相A

流动相B

0

100

0

2

100

0

15

90

10

25

70

30

33

55

45

33.1

0

100

38

0

100

38.1

100

0

45

100

0

(4) 实验结果与讨论

4.1 液相条件的建立

样品中氨基酸含量比较低,而且直接检测溶剂效应较大,经过衍生后直接检测样品中的氨基酸不能完全分离,本文通过用水稀释衍生溶液的方法降低检测中的溶剂效应,并且经过优化流动相梯度使18种氨基酸得到良好的分离。

但是实际检测过程中相同的检测条件下,仪器不同,分离效果差别较大,有的甚至都完全分不开,为此本文还开发了一种基础检测条件,可以根据仪器的自身特点,稍加调整流动相的比例即可使18种氨基酸得到较好的分离。

基础检测条件如表2所示。

表2 流动相基础梯度变化表:

时间

流动相A

流动相B

0

100

0

15

92

8

25

78

22

36

64

36

38

0

100

43

0

100

43.1

100

0

50

100

0

4.2 检测方法的稳定性、线性及准确性

氨基酸标准品按照2方法衍生后,相同的条件下连续重复进样6次,计算相对标准偏差,结果如表3所示。由结果可知该方法比较稳定,可以用来检测氨基酸样品,其实验谱图如图1所示。

根据仪器对各个物质的响应情况,将氨基酸标准溶液分别稀释成2.5μmol/mL(胱氨酸为1.25μmol/mL)、1.25μmol/mL(胱氨酸为0.625μmol/mL)、0.5μmol/mL(胱氨酸为0.25μmol/mL)、0.25μmol/mL(胱氨酸为0.125μmol/mL)、0.125μmol/mL(胱氨酸为0.0625μmol/mL)5个浓度,然后按照2的衍生方法同时衍生处理,样品经稀释过滤后在相同的实验条件下进样,依据进样浓度X(μmol/mL)为横坐标,峰面积Y为纵坐标进行线性回归,根据各个物质峰高、噪音,遵循S/N=3计算出最低检出限,回归方程及检出限见表3。可见,在选定的液相色谱条件下氨基酸标准溶液的响应与浓度呈良好的线性关系。

表3 氨基酸的线性回归方程、标准偏差和检出限:

名称

线性回归方程

相关系数r2

峰面积RSD6

时间RSD6

检出限(μmol/mL)

门冬氨酸

Y=405.5x

0.9974

0.34%

0.06%

0.025

谷氨酸

Y=401.1x+35.8

0.9965

0.38%

0.14%

0.034

丝氨酸

Y=503.2x+25.5

0.999

0.47%

0.10%

0.039

甘氨酸

Y=689.0x-29.2

0.9997

0.35%

0.09%

0.03

组氨酸

Y=581.2x+1.40

0.9999

0.33%

0.10%

0.034

精氨酸

Y=542.0x+14.5

0.9996

0.28%

0.10%

0.038

苏氨酸

Y=441.8x+29.6

0.9987

0.10%

0.07%

0.047

丙氨酸

Y=753.6x-22.9

0.9998

0.19%

0.07%

0.04

脯氨酸

Y=563.9x-6.20

0.9992

0.29%

0.05%

0.028

酪氨酸

Y=0.0016x-0.0034

1

0.11%

0.04%

0.02

缬氨酸

Y=0.0015x+0.0075

1

0.22%

0.02%

0.021

甲硫氨酸

Y=0.0014+0.0325

0.9999

0.60%

0.02%

0.022

胱氨酸

Y=9.344x-1185

0.6984

16.80%

0.03%

0.043

异亮氨酸

Y=0.0014x-0.024

0.9995

0.20%

0.02%

0.019

亮氨酸

Y=0.0014x+0.0211

0.9999

0.56%

0.01%

0.019

正亮氨酸

-

-

0.43%

0.01%

-

苯丙氨酸

Y=0.0013x+0.0038

1

0.47%

0.01%

0.018

赖氨酸

Y=0.0008x+0.024

1

0.27%

0.01%

0.011

图1 氨基酸标准偏差试验色谱图:

为了验证建立方法的准确性,本文用Sigma氨基酸标准品为样品,以博纳艾杰尔科技的标准品为标准品通过相同的方法衍生和检测得出检测值与标示值之间的偏差,除胱氨酸外,偏差均小于3%,接近标准品的标示值,证明该方法准确性高,检测效果稳定。实验结果如表4。

因为半胱氨酸在碱性环境下能够转化成胱氨酸,所以经碱水解后胱氨酸的含量不稳定,此外有时两个半胱氨酸残基会发生二硫键交联,经异硫氰酸苯酯衍生后的胱氨酸也不稳定,非常容易分解,所以胱氨酸的相关系数和偏差都比较大。

氨基酸标准溶液

Sigma  (稀释5倍)

分析包  (稀释5倍)

Sigma 标示浓度(原液)

分析包标示浓度(原液)

Sigma测得浓度(稀释5倍)

Sigma测得浓度与标示浓度间的误差

中文名

Area1

Area2

Area1

Area2

μmol/mL

μmol/mL

μmol/mL

(%)

门冬氨酸

633.9

634.9

644

645

2.5

2.5

0.497

-0.6

谷氨酸

650.3

650.5

669.9

670.9

2.5

2.5

0.4898

-2

丝氨酸

707.2

709.8

728.2

728.5

2.5

2.5

0.4911

-1.8

甘氨酸

697.2

698.8

697.2

698.7

2.5

2.5

0.5049

1

组氨酸

684.6

686.9

692.9

693.9

2.5

2.5

0.4993

-0.1

精氨酸

695

696.4

701

702.1

2.5

2.5

0.5007

0.1

苏氨酸

629.3

629.6

633.7

633.9

2.5

2.5

0.5014

0.3

丙氨酸

676.7

678.3

681.7

682.7

2.5

2.5

0.5014

0.3

脯氨酸

780.4

779.9

781.3

782.1

2.5

2.5

0.5039

0.8

酪氨酸

756.3

757.8

759.6

761.6

2.5

2.5

0.5025

0.5

缬氨酸

795.6

780.2

786

788.2

2.5

2.5

0.5054

1.1

甲硫氨酸

785.1

778.2

789.3

789.6

2.5

2.5

0.4999

0

胱氨酸

430.8

416.3

328.7

320.9

1.25

1.25

0.3292

31.7

异亮氨酸

848.2

840.8

836.1

836.2

2.5

2.5

0.5099

2

亮氨酸

764.3

756.9

780.2

781.7

2.5

2.5

0.4917

-1.7

正亮氨酸

1300.2

1294.6

1308.6

1311.6

-

-

-

-

苯丙氨酸

862.6

868.4

896.8

896.8

2.5

2.5

0.4873

-2.5

赖氨酸

1249.4

1257.8

1291.9

1298.5

2.5

2.5

0.4887

-2.3

4.3 样品检测结果

按照上述方法检测处理后的饲料样品可得色谱图如图2、图3,通过单点校正法可以得出样品1和样品2中含有标准品中的17种氨基酸。

图 2 实际样品1 色谱图:

图 3 实际样品2 色谱图:

样品中的17种氨基酸均能得到良好的分离,这说明在有基质干扰的情况下本文建立的这种方法同样适用,而且样品连续进样重复性非常好,未出现样品变质或者峰型变差的现象,证明本文建立的方法在有基质干扰的情况下也同样克服了衍生氨基酸容易分解的问题。

4.4 实验结论

按照上述实验条件,可以准确检测饲料样品中17种氨基酸,同时检测的灵敏度及线性都能满足检测的要求,而且本方法准确性高,与样品中含有氨基酸的真值偏差非常小,所以该方法可以准确的检测饲料样品中的氨基酸。

(5) 订货信息:

产品名称

规格包装

订货号

LC-10F高效液相色谱仪

10mL/min, 梯度系统,  200-800nm双波长检测器

FL-LC010GS

CC-100分析型色谱柱温箱

温控范围:5-70℃;可安装1-2支300mm色谱柱

CC-100

Venusil  AA氨基酸分析方法包

包含以下产品(不含色氨酸)

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Venusil AA氨基酸分析专用色谱柱(4.6×250mm, 5μm)

AA952505-0

异硫氰酸苯酯(PITC), 10×25μL

AA-D

17种氨基酸标准溶液,2×1mL

AA-S

正亮氨酸(Nle), 1×100mg

AA-I

2×1.4mL

AA-B

色氨酸(Trp)

1×100mg

AA-T

针式过滤器(Nylon)

0.22μm, 直径13mm,  200/pk

AS021320

一次性无针头注射器

5mL, 100/pk

ZSQ-5ML

1.5mL样品瓶

短螺纹透明带书写32×11.6mm,  100/pk

1109-0519

1.5mL样品瓶盖

9  mm中心孔蓝盖,红色橡胶/米色PTFE隔垫,45.Shore A 1.0mm,100/pk

0915-1819

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应用编号:AF10023

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