博纳艾杰尔 Agela Technologies

客服热线:400-606-8099
高级搜索
快速订购
最近加入的产品:
购物车里共有有 0 件产品

乳制品中L-羟脯氨酸的测定方法学验证---异硫氰酸苯酯(PITC)法

应用简介

本实验采用高效液相色谱(HPLC) 法结合紫外检测器,使用Venusil®AA氨基酸专用分析柱,以异硫氰酸苯酯(PITC)为柱前衍生剂,运用外标法,对部分市售乳制品中L-羟脯氨酸进行测试。实验结果表明,在波长254 nm,流速为1.0 mL/min,以0.1mol/L醋酸钠缓冲液(pH=6.5)与80%乙腈为流动相进行梯度洗脱,L-羟脯氨酸线性范围为0.125-6.25mg/L,相关系数大于0.999,平均回收率在90-110%之间,平行样品的相对标准偏差小于5.0%,方法检出限为1.5mg/kg。本方法灵敏度高、重复性好,可用于乳制品中L-羟脯氨酸的检测。

收藏

皮革奶,是用皮革水解蛋白生产出来的乳制品,加入到乳制品中的目的是提高产品蛋白含量。皮革水解蛋白本身对人体无害,但由于皮革水解蛋白中混进了大量皮革糅制、染色过程中添加进来的重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质,长期服用会导致重金属中毒。L-羟脯氨酸是胶原蛋白(皮革水解蛋白)特征性成份之一,而乳制品中的乳蛋白中不存在,故将L-羟脯氨酸的检测作为判定乳及乳制品中是否含有水解蛋白的依据。

本实验采用异硫氰酸苯酯(PITC)作为衍生剂,使用Venusil® AA氨基酸分析专用柱对5种市售乳制品中L-羟脯氨酸进行测试。

实验部分

仪器、试剂与材料

主要仪器设备

Agilent 1100高效液相色谱仪、Agela Technology 15位干式电模块氮吹仪;

试剂材料

色谱柱:Venusil®AA;5 μm;4.6 × 250 mm;

L-羟脯氨酸标准品:白色晶体,纯度≥98%;异硫氰酸苯酯:纯度≥99.0%;屈臣氏蒸馏水;乙腈为色谱纯;无水醋酸钠、苯酚、浓盐酸、冰醋酸均为分析纯;

水解液:6.0 mol/L盐酸溶液(含1%苯酚);

稀盐酸:0.1 mol/L盐酸;

三乙胺乙腈溶液:取三乙胺1.4 mL,加乙腈8.6 mL,混匀;

异硫氰酸苯酯乙腈溶液:取异硫氰酸苯酯25 μL,加乙腈2 mL,混匀;

0.1mol/L醋酸钠缓冲液(Ph=6.5):称取8.23g无水醋酸钠,加1000mL水溶解,冰醋酸调节pH至6.5;

标准储备液1000 μg/mL:准确称取10 mg标准品于10 mL容量瓶中,用0.1 mol/L盐酸溶解并定容至刻度,即得;

标准工作液100 μg/mL:用0.1mol/L盐酸稀释标准储备液至100 μg/mL。

样品水解

准确称取样品1 g(奶粉样品称取0.2 g),置于12 mL水解管中,加入8 mL水解液,振摇使样品均匀分散于溶液中,然后将水解管置110℃烘箱中水解24小时,取出冷却,打开水解管,将水解液全部转移至20 mL玻璃试管中,用0.1moL/L盐酸定容到刻度,混匀,过滤,取滤液,作为衍生用样品溶液。

样品衍生

准确量取衍生用样品溶液1.0 mL,置一玻璃管中,用氮吹仪于50℃下氮吹至干,残渣加1.0 mL 稀盐酸复溶,混匀,量取200 μL水解后样品溶液于5 mL玻璃试管中,依次加入100 μL三乙胺乙腈溶液,100 μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液,摇匀,于室温下放置1 h,然后加入正己烷800 μL,振摇后放置10分钟,取下层溶液,用0.45 μm滤膜过滤,取续滤液200 μL,加水800 μL稀释后上机测试。

L-羟脯氨酸标准曲线的绘制用L-羟脯氨酸标准工作液分别配成0.125、0.25、1.25、2.5、6.25 μg/mL的标准系列溶液,采用上述衍生方法,使用外标法定量,绘制标准曲线。

色谱条件

色谱柱:Venusil®AA;5 μm;4.6 × 250 mm;

流 速:1.0 mL/min;

柱 温:40 ℃;

波长:254 nm;

进样量:20 μL;

流动相A:0.1 mol/L醋酸钠缓冲液(冰醋酸调节pH=6.5) ︰乙腈=1000︰75;

流动相B:乙腈︰水=80︰20;

梯 度:

表1.梯度洗脱程序

时间/min

A/%

B/%

0

100

0

2

100

0

10

88

12

19

70

30

21

50

50

22

0

100

26

0

100

26.1

100

0

30

100

0

结果与讨论

方法学考察

标准曲线及检出限

按照上述色谱条件,分别对L-羟脯氨酸系列标准溶液进样测试,L-羟脯氨酸在浓度0.125-6.25mg/L范围内有线性关系良好,回归方程为y = 12.607x + 0.5205,相关系数为0.9999,检出限(S/N=3)为1.5 mg/kg。

方法的精密度与回收率

精密度实验

在上述色谱条件下,使用1.25 μg/mL标准溶液连续进样6次对仪器精密度进行测试,表明方法重现性好,结果见下表2。

表2. 重复性实验数据


保留时间/min

峰面积

平均值

7.818

17.2

RSD/%

0.30

0.90

市售乳制品检测及加标回收实验按上述的处理方法,对5种市售乳制品(牛奶、乳品饮料、奶粉、原味酸奶及大果粒酸奶) 分别进行加标实验,并计算回收率,加标浓度及回收率结果见表3,L-羟脯氨酸的加标平均回收率在90-110%之间,相对标准偏差小于5%,该方法的回收率好。

表3. 市售乳制品中L-羟脯氨酸的相关回收率

市售乳制品

加标浓度(mg/Kg)

平均回收率/%

RSD/%

奶粉

50

106.6

3.12

125

103.1

1.79

625

89.3

2.00

牛奶

10

91.8

3.27

25

100.6

2.34

125

96.7

0.86

乳品饮料

10

108.2

3.06

25

101.9

1.08

125

99.9

0.87

酸奶

10

109.8

3.34

25

102.5

4.56

125

99.8

1.23

大果粒

10

109.8

3.22

25

100.6

1.72

125

103.3

1.16

结论

根据实验结果,采用Venusil®AA氨基酸分析专用柱,以异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生试剂测试乳制品中的L-羟脯氨酸,方法灵敏度高、重现性好,可用于判定乳制品中是否添加皮革水解蛋白。

附:相关产品

产品名称

规格描述

包装数量

订货号

Venusil®AA氨基酸分析专用柱

4.6   × 250 mm5 μm

1

AA952505-0

12   mL螺纹棕色样品瓶

66*18.5mm

100/PK

1509-1800

1.5mL棕色样品瓶

短螺纹棕色;带书写处

32 × 11.6 mm

100/PK

AV1011-0

1.5 mL样品瓶盖

9 mm中心孔蓝盖,红色橡胶/米色PTFE隔垫

45°Shore A1.0 mm

100/PK

0915-1819

微孔滤膜

单膜,13 mm0.45 μm

100/

AS021345-T

一次性注射器

2 mL无针头

100/

LZSQ-2ML

乙腈

4 L/瓶,色谱纯

4×4 L/

AH015-4

应用编号:AF10092

  • 氨基酸分析对照品

    氨基酸分析对照品

  • 氨基酸专用分析方法包

    博纳艾杰尔科技推出的Venusil® AA 氨基酸分析方法是基于目前广泛使用的PITC( 异硫氰酸苯酯) 衍生剂的HPLC 氨基酸分析方法。简化了衍生方法,衍生方便、快速,衍生物单一、稳定,-20 可贮存数月;4 水溶液3 天;分析时间短;结果准确,试剂、副产物、溶剂等多种干扰因素可通过快速蒸发去除;紫外检测(254nm) 灵敏度高,可达到1 pmol;一、二级氨基酸均可检测。是目前氨基酸分析中最具吸引力的分析方法

  • ND9(广口)

    广口短螺纹样品瓶 适配:Agilent Thermo Scientific Varian Waters etc.

  • 尼龙过滤膜(Nylon通用)

    尼龙过滤膜(Nylon通用)

  • HPLC 过滤专用一次性注射器

    专业医用注射器厂家生产;节约成本;无需按医疗废弃物处理。

产品数量修改成功!
总价为:

关闭

登录

X
Email
密码
注册找回密码