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乳制品中L-羟脯氨酸的测定方法学验证——---2,4-二硝基氟苯法

应用简介

本实验采用高效液相色谱(HPLC) 法结合紫外检测器,使用Venusil®AA氨基酸专用分析柱,以1%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液为柱前衍生剂,运用外标法,对部分市售乳制品中的L-羟脯氨酸进行测试。实验结果表明,在波长360 nm,0.02mol/L磷酸盐缓冲液与乙腈、甲醇为流动相,于1.0 mL/min流速梯度洗脱下,L-羟脯氨酸线性范围为0.125-6.25 mg/L,相关系数大于0.999,平均回收率在85-110%之间,平行样品的相对标准偏差小于6.0%,方法检出限为0.8 mg/kg。本方法的灵敏度、准确度和精密度较好,适用于乳制品中L-羟脯氨酸的检测。

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皮革奶,是用皮革水解蛋白生产出来的乳制品,加入到乳制品中的目的是提高产品蛋白含量。皮革水解蛋白本身对人体无害,但由于皮革水解蛋白中混进了大量皮革糅制、染色过程中添加进来的重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质,长期服用会导致重金属中毒。L-羟脯氨酸是胶原蛋白(皮革水解蛋白)特征性成份之一,而乳制品中的乳蛋白中不存在,故将L-羟脯氨酸的检测作为判定乳及乳制品中是否含有水解蛋白的依据。

本实验采用2,4-二硝基氟苯作为衍生剂,使用Venusil® AA氨基酸分析专用柱对5种市售乳制品中的L-羟脯氨酸进行测试。

实验部分

仪器、试剂与材料

主要仪器设备

Agilent 1100高效液相色谱仪、Agela Technology 15位干式电模块氮吹仪;

试剂材料

色谱柱:Venusil®AA;5 μm;4.6 × 250 mm;

L-羟脯氨酸标准品:白色晶体,纯度≥98%;2,4-二硝基氟苯:购自Sigma 公司;屈臣氏蒸馏水;甲醇、乙腈为色谱纯;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、四水合硼酸钠、苯酚、浓盐酸均为分析纯;

水解液:6.0 mol/L 盐酸溶液(含1%苯酚);

稀盐酸:0.1 mol/L 盐酸;

0.02mol/L 磷酸盐缓冲液:称取2.72g 磷酸二氢钾与4.56g 磷酸氢二钾,加1000mL水溶解,即得;

硼酸盐水溶液:准确称取 1.91 g 四水合硼酸钠,加50 mL 水溶解,混匀;

2,4-二硝基氟苯溶液:1% 的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液;

标准储备液:准确称取10 mg 标准品于10 mL 容量瓶中,用0.1 mol/L 盐酸溶解并定容至刻度,即得;

标准工作液:用0.1mol/L 盐酸稀释标准储备液至100 μg/mL;

测试对象:市售牛奶、乳品饮料、奶粉、原味酸奶及大果粒酸奶。

样品处理

样品水解

准确称取样品 1.0 g(奶粉样品称取0.2 g) 样品,置于12 mL 棕色蛋白水解瓶中,加入8 mL 水解液,振摇使样品均匀分散于溶液中,然后将水解管置110 ± 1 ℃烘箱中水解24 小时,取出冷却,打开水解管,将水解液全部转移至20 mL 试管中,用0.1moL/L盐酸定容到刻度,混匀,过滤,取续滤液,作为衍生用样品溶液。

样品衍生

准确量取衍生用样品溶液 1.0 mL,置一玻璃管中,至氮吹仪中以50℃氮吹至干,残渣加1.0 mL 稀盐酸复溶,混匀,量取0.5 mL 置于5.0 mL 棕色瓶中,加入0.5mL 硼酸钠溶液,2,4 二硝基氟苯乙腈溶液0.5 mL,摇匀,于60 ℃烘箱中加热1 h,将试管于冷水浴中冷却,用0.02 mol/L 的磷酸氢二钠与磷酸二氢钠混合溶液定容至2.0 mL。

L-羟脯氨酸标准曲线的绘制

用 L-羟脯氨酸标准工作液分别制成0.125、0.25、1.25、2.5、6.25 μg/mL 的系列浓度标准溶液,采用上述衍生方法,使用外标法定量,绘制标准曲线。

色谱条件

色谱柱:Venusil®AA;5 μm;4.6 × 250 mm;

流速:1.0 mL/min;

柱 温:30 ℃;

波 长:360 nm;

进样量:20 μL;

流动相 A:0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液;

流动相 B:乙腈︰甲醇=1︰1(v/v);

梯 度:

表 1.梯度洗脱程序

时间/min

A/%

B/%

0

83

17

14

85

15

20

85

15

22

70

30

26

83

17

30

83

17

结果与讨论

方法学考察

标准曲线及检出限

按照上述色谱条件,分别对L-羟脯氨酸系列标准溶液进样测试,L-羟脯氨酸在浓度0.125-6.25mg/L 范围内有较好的线性关系,回归方程为y=35.962x-0.2802;相关系数为0.9998,检出限(S/N=3)为0.8 mg/kg。

方法的精密度与回收率

精密度实验

在上述色谱条件下,使用 0.25 μg/mL 标准溶液连续进样6 次对仪器精密度进行测试,实验结果表明方法重复性好,结果见下表2。

表 2. 重复性试验数据


保留时间/min

峰面积

平均值

7.041

9.2

SD

0.04

0.15

RSD/%

0.58

1.61

市售乳制品检测及加标回收实验

按上述的处理方法,对 5 种市售乳制品(牛奶、乳品饮料、奶粉、原味酸奶及大果粒酸奶) 分别进行加标实验,并计算回收率,加标浓度及回收率结果见表3,L-羟脯氨酸的加标平均回收率在85-110%之间,相对标准偏差小于6%,方法的回收率较好。

表 3. 市售乳制品中L-羟脯氨酸的相关回收率

市售乳制品

加标浓度(mg/Kg)

平均回收率/%

RSD/%

奶粉

13

106.3

5.54

25

100.0

3.41

125

109.3

0.54

牛奶

2.6

94.4

3.37

5

100.0

1.14

25

95.7

1.31

乳品饮料

2.6

104.1

3.46

5

103.0

1.27

25

102.1

1.06

酸奶

2.6

85.4

3.76

5

95.8

2.47

25

101.9

2.16

大果粒酸奶

2.6

96.5

3.30

5

95.5

2.38

25

98.1

1.58

图2.标准溶液1.25 μg/mL 高效液相色谱图(纵坐标局部放大图)

结论

根据实验结果,采用 Venusil®AA 氨基酸分析专用柱,以2,4-二硝基氟苯为衍生试剂测试乳制品中的L-羟脯氨酸,方法灵敏度高、重现性好,可用于判定乳制品中是否添加皮革水解蛋白。

附:相关产品

产品名称

规格描述

包装数量

订货号

Venusil®AA氨基酸分析专用柱

4.6 × 250 mm5 μm

1

AA952505-0

12 mL螺纹棕色样品瓶

66*18.5mm

100/PK

1509-1800

1.5mL棕色样品瓶

短螺纹棕色;带书写处

32 × 11.6    mm

100/PK

AV1011-0

1.5 mL样品瓶盖

9 mm中心孔蓝盖,红色橡胶/米色PTFE隔垫

45°Shore   A1.0 mm

100/PK

0915-1819

微孔滤膜

单膜,13 mm0.45 μm

100/

AS021345-T

一次性注射器

2 mL无针头

100/

LZSQ-2ML

甲醇

4 L/瓶,色谱纯

4×4 L/

AH230-4

乙腈

4 L/瓶,色谱纯

4×4 L/

AH015-4

应用编号:AF10093

  • 氨基酸分析对照品

    氨基酸分析对照品

  • 氨基酸专用分析方法包

    博纳艾杰尔科技推出的Venusil® AA 氨基酸分析方法是基于目前广泛使用的PITC( 异硫氰酸苯酯) 衍生剂的HPLC 氨基酸分析方法。简化了衍生方法,衍生方便、快速,衍生物单一、稳定,-20 可贮存数月;4 水溶液3 天;分析时间短;结果准确,试剂、副产物、溶剂等多种干扰因素可通过快速蒸发去除;紫外检测(254nm) 灵敏度高,可达到1 pmol;一、二级氨基酸均可检测。是目前氨基酸分析中最具吸引力的分析方法

  • ND9(广口)

    广口短螺纹样品瓶 适配:Agilent Thermo Scientific Varian Waters etc.

  • 尼龙(Nylon通用)

    广泛的化学相容性(避强酸),良好的柔韧性 ,与大多数试剂相容,低蛋白吸附。 应用于电子、微电子、半导体工业水过滤;药液、饮料、高纯化学品的过滤

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