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LC-MS/MS法检测血清中叶酸及5-甲基四氢叶酸的含量-Cleanert PAX

应用简介

叶酸:人血浆中主要以5-甲基四氢叶酸形式存在。研究表明,叶酸除了与巨幼红细胞性贫血有关以外,还与神经管畸形、某些癌症( 如结肠癌)、心脑血管疾病以及儿童智力低下有关。因此,快速、准确地测定人组织中的叶酸,对于预防、诊断和治疗由叶酸引起的疾病都有十分重要的意义。

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叶酸是20 世纪40 年代中后期被发现分离出来的水溶性B 族维生素,是具有喋酰古氨酸分子结构的一类化合物的总称。自然界存在100多种叶酸衍生物,在人血浆中主要以5-甲基四氢叶酸形式存在。研究表明,叶酸除了与巨幼红细胞性贫血有关以外,还与神经管畸形、某些癌症( 如结肠癌)、心脑血管疾病以及儿童智力低下有关。因此,快速、准确地测定人组织中的叶酸,对于预防、诊断和治疗由叶酸引起的疾病都有十分重要的意义。由于叶酸的稳定性差且组成复杂,因此对叶酸的分析具有很大挑战。本应用案例采用Cleanert PAX 96孔板进行血清中叶酸及5-甲基四氢叶酸含量检测样品预处理,并使用LC-MS/MS进行样品测试,实验方法具有良好的稳定性及可靠性。

目标物信息

图1 叶酸结构图

图2 5-甲基四氢叶酸结构图

材料及仪器

Cleanert PAX 96孔板(30 mg/well), 96位氮吹仪,96位正压装置,96孔接收板,Venusil MP C18(2)(3.0*100mm, 3μm, 110Å),以上产品均为天津博纳艾杰尔科技有限公司产品;LC/MS/MS型号为API 4000+(SCIEX)。

样品处理方法

样品预处理

由于叶酸稳定性差,为防止叶酸分解,在实验中需要加入抗氧化剂,所用抗氧化剂为维生素C、2-巯基乙醇。取400 μL样品至2 mL离心管中,加入400 μL水溶液,振荡混匀2 min,待净化。

SPE过程

活化:依次加入1 mL甲醇,500μL水,500μL含抗氧化剂的水溶液,使用正压装置将溶液压下;

上样:将混合好的800 μL溶液上样,自然流下;

淋洗:依次加入含抗氧化剂的500μL 0.1%甲酸水溶液,250 μL含抗氧化剂的甲醇溶液,使用正压装置,吹干;

洗脱:500ul 2% 甲酸甲醇洗脱,自然流下;将洗脱液在37℃下温和氮吹干,使用100μL水复溶,进样检测。

仪器检测条件

HPLC条件

色谱柱:Venusil MP C18(2)(3.00*100mm,3μm,110Å)

流速:500μL/min

柱温:30℃

进样量:10μL

流动相:A-0.1%甲酸水溶液B-0.1%甲酸甲醇

表1 梯度条件

T

A%

B%

0

95

5

1

95

5

1.01

20

80

5

20

80

5.01

95

5

10

95

5

质谱条件

扫描模式:电喷雾电离正模式

采集模式:多反应监测(MRM)

表2 参数信息

化合物

保留时间/min

Q1

Q3

CE

叶酸

3.73

442.4

295.1

26

442.4

175.9

56

5-甲基四氢叶酸

3.54

460.3

313.2

23

460.3

193.6

43

结果

图3 标准溶液色谱图(20ng/mL)

图4 血清样品色谱图

图5 血清加标样色谱图(加标浓度20ng/mL)

图6 后加标样色谱图(浓度20ng/mL)

血清中叶酸临床指标为6–20.1 ng/mL(正常)、3.0—6.0 ng/mL(不确定)、≤3.0 ng/mL(临床表现缺乏),为考察方法精密度与准确度,取加标浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、20ng/mL的血清样作为方法学考察样品,结果见表3,为考察基质效应,本实验进行后加标操作,结果表明基质效应因子<9%。

根据目标物响应,将样品进行稀释并进行重复测定,标示浓度与计算值偏差在±20%之内,获得叶酸、5-甲基四氢叶酸的最低定量浓度分别为0.05ng/mL、0.08ng/mL.

表3 血清加标回收率

目标物

加标浓度1ng/mL

加标浓度5ng/mL

加标浓度20ng/mL

平均回收率(n=5)

RSD

(n=5)

平均回收率

(n=5)

RSD

(n=5)

平均回收率(n=5)

RSD(n=5)

5-甲基四氢叶酸

89.6%

8.9%

105.8%

5.4%

101.2%

3.3%

叶酸

91.5%

10.2%

99.4%

3.7%

95.8%

2.3%

结论

本实验使用Cleanert® PAX提取血清中的叶酸和5-甲基四氢叶酸,在1ng/mL-20ng/mL回收率均大于89%,RSD低浓度时不高于11%,高浓度时小于5%,叶酸、5-甲基四氢叶酸的最低定量浓度分别为0.05ng/mL、0.08ng/mL。同时使用96孔正压和氮吹装置大大提高了样品的处理速度,能充分满足实验室的检测需求。

订货信息表

产品名称

规格/包装

订货号

Cleanert PAX 96孔板

96孔板,30mg/well

AX0302-W

Cleanert M96 生物样品前处理仪

96孔板匹配

SPE-M96

Cleanert V96 氮吹浓缩仪

96孔板匹配

NV-96G

Venusil MP C18(2)

3.0*100mm,3μm,110   Å

VA931003-2

96位接收板

1mL/well,与96孔板匹配

96SP1036

甲醇

LC-MS, 4*2.5L

LC230

LC-MS级,4*2.5L/

LC365

应用编号:YB10003

  • Cleanert PAX

    Cleanert PAX 是以阴离子交换混合机理水可浸润型聚合物为基质的萃取小柱。在pH 0~14.0 范围内多很稳定。用于提取生物基质的酸性化合物及其代谢产物。

  • Cleanert V96 氮吹浓缩仪

    Cleanert V96 氮吹浓缩仪是专为快速高效蒸发溶剂、浓缩样品而设计,采用独特氮气加热方式,保温传热管导入气体,同时作用于每个样品管,受热均匀,浓缩效率高,一致性好。

  • Cleanert M96 生物样品前处理仪

    Cleanert M96 生物样品前处理仪是专为高通量药物研发及临床药物检测而设计的一款正压型样品前处理装置,适用于96孔蛋白沉淀板、固相萃取板、SLE板、MAS板及过滤板。具有设计紧凑、操作简单、使用方便的特点。

  • Venusil MP C18

    Venusil MP C18 是一款通用型制备柱,适用于分离 极性和非极性化合物。

  • Cleanert PPT 96 孔蛋白沉淀板

    Cleanert PPT 产品系列采用高纯蛋白沉淀专用筛板,可以有效阻截乙腈等常用蛋白沉淀溶剂,不会发生穿透现象,在样品处理完毕后,施加正压或负压用以收集流出液;从而实现血浆(或血清、尿液等)样品处理的高通量化处理,节省研究人员的体力和宝贵时间。该系列产品兼容各种自动化前处理装置,方便快捷,是一款高通量的前处理产品;

  • Burdick&Jackson溶剂

    Burdick&Jackson 是美国Honeywell( 霍尼韦尔) 跨国公司下属专门生产溶剂系列的生产商,为全美溶剂市场占有率最大的公司。B&J 提供46 种不同品种和规格的溶剂,可满足气相、液相、分光光度、农药残留分析,有机合成等方面的应用。作为高纯溶剂生产商,B&J 以ISO9001 作为质量保证体系,并且可满足GMP 用户的要求。

资料名称 资料形式 时间
样本 2016年03月16日
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