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使用Cleanert SLE快速净化血清中25-羟基维生素D

应用简介

维生素D缺乏症可以引发骨矿化受损以及多种与骨骼相关的疾病,儿童可能会出现佝偻病,成人可能会出现骨软化和骨质疏松症。25-羟基维生素D是维生素D营养水平的标志物,液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)具有特异性强、准确性高的特点,被认为是评价维生素D营养状况的“黄金标准”测定法。

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25-羟基维生素D,简称25-OH VD,包括25-羟基维生素D2(25-OH VD2)和25-羟基维生素D3(25-OH VD3)作为维生素D在体内的主要代谢形式之一,由于其半衰期长、存在形式稳定而被认为是维生素D营养水平的标志物。如何快速准确检测人体内维生素D的水平越来越受到广大学者和医患人员的重视。液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)具有特异性强、准确性高的特点,被认为是评价维生素D营养状况的“黄金标准”测定法。本应用案例采用Cleanert SLE 96孔板进行血清样品前处理,并使用LC-MS/MS进行样品测试,结果表明该实验方法具有良好的稳定性及可靠性,可为临床研究提供一种解决方案。

目标物信息

材料及仪器

Cleanert SLE 96孔板(300mg/well)、Cleanert M96 生物样品前处理仪、Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪、96孔接收板及Durashell C18-L(3.0*50 mm, 5 μm, 150 Å)均来自天津博纳艾杰尔科技有限公司;LC-MS/MS, QTRAP 5500(SCIEX);25-OH VD2,25-OH VD3,d3-25-OH VD2以上三种标准品由合作单位提供赞助;d6-25-OH VD3(购自Altascientific);甲醇;甲酸;水;氢氧化钠;异辛烷。

样品处理方法

样品预处理

取100 μL血清至洁净样品瓶中,加入内标溶液,再加入100 μL 50 mM氢氧化钠水溶液混匀后待净化。

SLE过程

上样:把预处理的样品全部上样,待全部浸润后静置5 min。

洗脱:用2 mL的异辛烷进行洗脱,每次洗脱加入500 μL,最后一步洗脱结束,将Cleanert SLE与收集板整体放到Cleanert M96 生物样品前处理仪上,开启压力至0.02 MPa,约30 s,完全收集洗脱液。

将洗脱液室温下用Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪进行温和氮吹干,使用200 μL 0.1% FA 甲醇/水(8/2)复溶,进样检测。

仪器检测条件

HPLC条件

色谱柱:Durashell C18-L(3.0*50 mm, 5 μm, 150 Å)

流速:500 μL/min

柱温:30 ℃

进样量:5 μL

表1 液相条件

Step

Total Time(min)

Flow Rate(µL/min)

0.1%甲酸 (%)

0.1%甲酸甲醇 (%)

0

0

500

10

90

1

3.5

500

10

90

质谱条件

扫描模式:电喷雾电离正模式

采集模式:多反应监测(MRM)

表2 参数信息

化合物

保留时间/min

Q1

Q3

CE

25-OH VD2

1.81

413.3

395.3

13.5

413.3

355.4

14.1

d3-25-OH VD2

1.79

416.5

398.4

12.3

416.5

358.5

15

25-OH VD3

1.71

401.5

383.5

13.8

401.5

365.5

15.1

d6-25-OH VD3

1.69

407.5

389.5

13.8

407.5

371.5

15.1

结果

线性范围与灵敏度

使用不含目标物的血清样品配制10个不同浓度的校准曲线点,25-OH VD2的浓度分别为:2、4、10、30、60、120、200、400、800、1000 ng/mL;25-OH VD3的浓度分别为:1、2、5、15、30、60、100、200、400、500 ng/mL;所得样品采用上述样品前处理方法净化样品并进行检测,获得结果见表3。

表3 线性范围及灵敏度

化合物

回归方程

相关系数(r2

方法定量限LOQ(ng/mL)

25-OH VD2

y=0.00691x+0.043

0.9998

1.1

25-OH VD3

y=0.0203x+0.398

0.9995

0.16

方法精密度与准确度

为考察方法精密度与准确度,取低、中、高三个浓度的样本,每个浓度平行处理5个样,获得数据见表4.

表4 精密度与准确度

化合物

加标浓度
  ng/mL

平均回收率
 
n=5

RSD
 
n=5

25-OH VD2

4

101.8%

8.3%

30

95.6%

7.2%

200

96.8%

4.0%

25-OH VD3

2

100.4%

12.9%

15

95.0%

6.1%

100

93.5%

4.3%

色谱图

将经Cleanert SLE净化的样品按上述LC-MS/MS测试条件进行测试,获得谱图见图3-4.

血样中大量存在的磷脂是造成液质联用基质效应的主要原因,为考察PPT、LLE与Cleanert SLE技术去除磷脂的能力,特取磷脂两对特征离子对进行考察:496/184, 524/184,获得对比图见图5-6.

图3 25-OH VD3血清加标色谱图(浓度为15 ng/mL)

图4 25-OH VD2血清加标色谱图(浓度为30 ng/mL)

图5 PPT-LLE-SLE样品磷脂对比谱图(离子对496/184)

图6 PPT-LLE-SLE样品磷脂对比谱图(离子对524/184)

结论

本应用呈现了一种简单、高效的样品前处理方法,通过Cleanert SLE 96孔板可高通量净化血样并萃取富集脂溶性维生素D代谢物25-OH VD2与25-OH VD3,本实验方法易操作且稳定,可在临床研究及药物代谢领域替代耗时、低效的液液萃取技术。

订货信息表

产品名称

规格/包装

订货号

Cleanert SLE 96孔板

96孔板

HC2002SQ-9W

Cleanert M96 生物样品前处理仪

96孔板匹配

SPE-M96

Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪

96孔板匹配

NV-96G

96孔收集板

2 mL/well,与96孔板匹配

96SP2036-2

Durashell C18-L

3.0*50mm5μm150 Å

DC950503-L

甲醇

LC-MS,   4*2.5L

LC230

LC-MS级,4*2.5L/

LC365

应用编号:YB10011

  • Cleanert SLE 系列 —— 传统液液萃取的终结者!

    Cleanert SLE 固相支持液液萃取产品,采用特殊工艺处理过的硅藻土,具有最大的比表面积和最低的表面活性,能够提供一个理想的液液分配的支撑表面,可以代替大部分传统的液液萃取方法。该方法可以应用于制药,药物代谢分析,生化分析,纺织业,食品,环境等多个领域

  • Cleanert V96 氮吹浓缩仪

    Cleanert V96 氮吹浓缩仪是专为快速高效蒸发溶剂、浓缩样品而设计,采用独特氮气加热方式,保温传热管导入气体,同时作用于每个样品管,受热均匀,浓缩效率高,一致性好。

  • Cleanert M96 生物样品前处理仪

    Cleanert M96 生物样品前处理仪是专为高通量药物研发及临床药物检测而设计的一款正压型样品前处理装置,适用于96孔蛋白沉淀板、固相萃取板、SLE板、MAS板及过滤板。具有设计紧凑、操作简单、使用方便的特点。

  • Durashell C18(L)

    Durashell 色谱柱通过硅胶表面杂化处理技术,在硅胶表面覆盖一种强疏水性保护层,有效防止碱性溶液对硅胶基质的破坏,因此Durashell 色谱柱可在高pH 下使用,并且对碱性化合物有极高的载样量,非常适合碱性化合物的制备分离。 同时,硅胶表面杂化处理可以减弱固定相和化合物间的疏水相互作用,保持高界面动力学系数,从而获得更高的柱效。

  • Burdick&Jackson溶剂

    Burdick&Jackson 是美国Honeywell( 霍尼韦尔) 跨国公司下属专门生产溶剂系列的生产商,为全美溶剂市场占有率最大的公司。B&J 提供46 种不同品种和规格的溶剂,可满足气相、液相、分光光度、农药残留分析,有机合成等方面的应用。作为高纯溶剂生产商,B&J 以ISO9001 作为质量保证体系,并且可满足GMP 用户的要求。

资料名称 资料形式 时间
样本 2016年03月16日
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