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Cleanert PPT应用于人血清中溶血磷脂酰胆碱的检测

应用简介

溶血磷脂酰胆碱(lyso-Phosphatidylcholines,LPCs)是磷脂的一种,具有多种生理功能,与糖尿病、动脉粥样硬化、血脂异常等代谢性疾病和心血管疾病密切相关。LPCs主要在肝脏代谢,在肝脏疾病和肝毒性中可发生明显变化;近年来,学者们对多种肝脏疾病和化学性肝毒性模型的大量研究均涉及了LPCs。

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背景

溶血磷脂酰胆碱(lyso-Phosphatidylcholines,LPCs)是磷脂的一种,具有多种生理功能,与糖尿病、动脉粥样硬化、血脂异常等代谢性疾病和心血管疾病密切相关。LPCs主要在肝脏代谢,在肝脏疾病和肝毒性中可发生明显变化;近年来,学者们对多种肝脏疾病和化学性肝毒性模型的大量研究均涉及了LPCs。

本应用案例介绍一种液相色谱-串联质谱的方法,采用Cleanert PPT 96孔板净化人血清样品,从血清样品中富集LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0五种溶血磷脂酰胆碱,该方法具有良好的稳定性及可靠性,可为溶血磷脂酰胆碱临床研究提供一种解决方案。

材料及仪器

Cleanert PPT 蛋白沉淀板,Cleanert M96 生物样品前处理仪Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪,96孔收集板,Durashell C18(L)(3.0*50 mm, 5 μm,150Å),以上产品均为天津博纳艾杰尔科技有限公司产品;LC-MS/MS, API 4000+(SCIEX);LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0(以上5种标准品购自Avanti);利血平(内标);甲醇;甲酸;水;生理盐水(0.9%);甲酸铵。

样品处理方法

样品混合

由于难以获得不含目标物的基质,本实验使用生理盐水代替人血清进行方法学验证试验。为保护人血中溶血磷脂酰胆碱,试验中使用的甲醇均含有0.1% 2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)。

标准曲线及重现性试验中,基质为生理盐水,试验中取20μL生理盐水,加入5μL 标准工作液,涡旋混合均匀,待下一步净化。

人血清加标试验中,取20μL血清,加入5μL 标准工作液,涡旋混合均匀,待下一步净化。

蛋白沉淀过程

先向Cleanert PPT每孔中加入150μL甲醇(含100ppb利血平),再加入预混合的样品,涡旋混合均匀,静置10min,使用Cleanert M96将溶液收集至洁净收集板内。

Cleanert V96温度设定为30℃,将收集板里的溶液氮吹干,使用1mL 80%甲醇水复溶,涡旋混合均匀,进样测试。

仪器检测条件

HPLC条件

色谱柱:Durashell C18(L) (3.0*50mm 5um 150Å)

流速:800uL/min

柱温:30℃

进样量:5 μL

流动相条件

Total Time(min)

0.1%甲酸25mM甲酸铵-水   (%)

0.1%甲酸-甲醇(%)

0

70

30

0.5

50

50

1

0

100

4

0

100

4.1

70

30

5

STOP

质谱条件

扫描模式:电喷雾电离正模式

采集模式:多反应监测(MRM)

表2 参数信息

目标物

tR/min

Q1

Q3

DP

CE

利血平

2

609.3

448.2

140

40

609.3

195*

120

45

C14:0

2.46

468.4

285.3

110

40

468.4

450.4*

120

27

C15:0

2.54

482.3

299.5

120

36

482.3

464.2*

120

28

C16:0

2.63

496.4

478.2*

124

16

C17:0

2.72

510.4

327.2

120

30

510.4

492.4*

120

20

C18:0

2.83

524.5

341.5

115

28

524.5

506.2*

127

18

注:*为定量离子对

结果

线性范围与灵敏度为考察方法线性范围,配置系列标准工作液,取5μL标准工作液至20μL生理盐水中进行前处理操作,获得的样品浓度参见 3中S1~S7,曲线方程等信息参见表3.

表3 标准曲线浓度及线性关系

项目

C14:0

C15:0

C16:0

C17:0

C18:0

S1/ppm

0.125

0.25

3.75

0.375

2.5

S2/ppm

0.25

0.5

7.5

0.75

5

S3/ppm

0.5

1

15

1.5

10

S4/ppm

1.25

2.5

37.5

3.75

25

S5/ppm

2.5

5

75

7.5

50

S6/ppm

3.75

7.5

112.5

11.25

75

S7/ppm

7.5

15

225

22.5

150

曲线方程

y=0.725x+0.00264

y=0.212x-0.0256

y=0.212x+0.268

y=0.366x+0.00653

y=0.31x+0.287

相关系数

0.9965

0.9913

0.9956

0.9938

0.9961

LOQ/ppm

0.027

0.12

0.32

0.059

0.072

方法精密度与准确度

实验中取生理盐水为基质,进行两个浓度(S3,S5)的加标回收率实验,分别进行两个平行样,结果见表4.

为考察方法精密度与准确度,取浓度水平为S3与S5分别进行8个样品的平行试验,S3对应LQC,S5对应HQC,基质为生理盐水,实验获得的数据见表5。

表4 生理盐水基质加标回收率数据

项目

C14:0

C15:0

C16:0

C17:0

C18:0

低加标浓度/ppm

1.25

2.5

37.5

3.75

25

高加标浓度/ppm

3.75

7.5

113

11.3

75

低-实测浓度-1/ppm

1.29

2.28

38.1

3.31

24.3

低-实测浓度-2/ppm

1.44

2.85

43

4.09

28.1

低-回收率-1

103.2%

91.2%

101.6%

88.3%

97.2%

低-回收率-2

114.4%

114.0%

114.7%

109.1%

112.4%

高-实测浓度-1/ppm

3.44

6.77

102

9.83

69.9

高-实测浓度-2/ppm

3.35

6.53

103

9.94

69

高-回收率-1

91.7%

90.3%

90.3%

87.0%

93.2%

高-回收率-2

89.3%

87.1%

91.2%

88.0%

92.0%

表5 生理盐水基质精密度与准确度数据

项目

C14:0

C15:0

C16:0

C17:0

C18:0

LQC平均回收率(n=8)

96.3%

99.9%

103.6%

96.6%

100.0%

CV(n=8)

6.3%

6.4%

8.5%

7.1%

7.0%

HQC平均回收率(n=8)

96.8%

99.1%

97.5%

93.8%

97.7%

CV(n=8)

11.3%

12.1%

12.3%

12.0%

11.3%

由表4及表5可见,此方法可用于处理及检测生理盐水基质中的溶血磷脂酰胆碱,为进一步考察方法对于血清样本的适应性,特取人血清进行加标回收率考察,获得数据见表6.由于人血清中含有浓度可观的溶血磷脂酰胆碱,实验检测两份人血清样品用于扣除内源性溶血磷脂酰胆碱,加标回收率计算公式为:

  

CA—加标样实测浓度

CM—人血清样品平均浓度

CS—加标浓度

表6 人血清基质实验数据

项目

C14:0

C15:0

C16:0

C17:0

C18:0

低加标浓度/ppm

1.25

2.5

37.5

3.75

25

高加标浓度/ppm

3.75

7.5

113

11.3

75

人血清样品-1/ppm

0.827

2.46

107

2.92

47.3

人血清样品-2/ppm

0.678

2.21

92

2.45

39.4

低-实测浓度-1/ppm

1.97

4.5

140

6.24

72

低-实测浓度-2/ppm

2.17

4.99

136

6.67

70

低-回收率-1

97.4%

86.6%

108.0%

94.8%

114.6%

低-回收率-2

113.4%

106.2%

97.3%

106.3%

106.6%

高-实测浓度-1/ppm

4.8

9.46

196

13.8

113

高-实测浓度-2/ppm

4.72

9.69

216

14.8

122

高-回收率-1

107.9%

95.0%

85.4%

98.4%

92.9%

高-回收率-2

105.3%

98.1%

103.1%

107.2%

104.9%

 

图1 标准曲线S2点色谱图

图2 人血样品色谱图

实验结论

本应用使用蛋白沉淀的方式对生理盐水及人血清进行前处理,并使用LC-MS/MS检测溶血磷脂酰胆碱,结果表明本方法简单、稳定、易操作,可快速处理检测人血清中溶血磷脂酰胆碱含量,用于临床研究。

实验所用产品列表

产品名称

规格/包装

订货号

Cleanert PPT

96孔板,1mL/well

96CD1025-M

Cleanert M96 生物样品前处理仪

与96孔板匹配

SPE-M96

Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪

与96孔板匹配

NV-96G

96孔收集板

2mL/well,与96孔板匹配

96SP2036-Y

Durashell C18(L)

3.0*50mm,5μm,150Å

DC950503-L

甲醇

LC-MS级,   4*2.5L

LC230

LC-MS级,4*2.5L/箱

LC365

  • Cleanert PPT 96 孔蛋白沉淀板

    Cleanert PPT 产品系列采用高纯蛋白沉淀专用筛板,可以有效阻截乙腈等常用蛋白沉淀溶剂,不会发生穿透现象,在样品处理完毕后,施加正压或负压用以收集流出液;从而实现血浆(或血清、尿液等)样品处理的高通量化处理,节省研究人员的体力和宝贵时间。该系列产品兼容各种自动化前处理装置,方便快捷,是一款高通量的前处理产品;

  • Cleanert M96 生物样品前处理仪

    Cleanert M96 生物样品前处理仪是专为高通量药物研发及临床药物检测而设计的一款正压型样品前处理装置,适用于96孔蛋白沉淀板、固相萃取板、SLE板、MAS板及过滤板。具有设计紧凑、操作简单、使用方便的特点。

  • Cleanert V96 氮吹浓缩仪

    Cleanert V96 氮吹浓缩仪是专为快速高效蒸发溶剂、浓缩样品而设计,采用独特氮气加热方式,保温传热管导入气体,同时作用于每个样品管,受热均匀,浓缩效率高,一致性好。

  • Durashell C18(L)

    Durashell 色谱柱通过硅胶表面杂化处理技术,在硅胶表面覆盖一种强疏水性保护层,有效防止碱性溶液对硅胶基质的破坏,因此Durashell 色谱柱可在高pH 下使用,并且对碱性化合物有极高的载样量,非常适合碱性化合物的制备分离。 同时,硅胶表面杂化处理可以减弱固定相和化合物间的疏水相互作用,保持高界面动力学系数,从而获得更高的柱效。

资料名称 资料形式 时间
样本 2016年05月26日
样本 2016年03月16日
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