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烤鱼中5种杂环胺类物质的分析方法

应用简介

本实验重现了GB5009.243-2016烤鱼中杂环胺类物质的测定,采用Cleanert® PS小柱结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)对烤鱼中的5种杂环胺类物质进行了测定。样品经40 g/L氢氧化钠︰甲醇=70︰30(V/V)溶液均质提取,Cleanert® PS小柱净化,以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈为流动相进行梯度洗脱,LC-MS/MS进行检测,外标法定量。结果表明,当加标量为0.01 mg/kg时,回收率在65% ~ 95%之间,能够满足检测要求。

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前言

70年代末,人们发现从烤鱼或烤肉提取的化合物具有致突变性,对烤鱼中主要致突变物的研究表明,这类物质主要是复杂的杂环胺类化合物(Heterocyclic amine)。长期实验表明,杂环胺在代谢活化系统中具有较强致突变性,并能引发啮齿动物以及灵长类动物肝脏、乳腺、结肠等多种靶器官产生肿瘤。与其他致癌物相比,杂环胺的毒性较强。

实验部分

仪器、试剂与材料

主要仪器设备

AB SCEIX API 4000+液相色谱串联质谱仪。

试剂材料

甲醇、乙腈、乙醇、正己烷、二氯甲烷均为色谱纯;氢氧化钠为分析纯;实验用水为超纯水;

5种杂环胺类物质混合标准工作溶液:MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx、PhIP:乙腈溶解;

基质混合标准工作溶液

取高浓度5种杂环胺类混合标准溶液,用空白样品基质溶液稀释成0.01 µg/mL的基质混合标准工作溶液。

Cleanert® PS固相萃取小柱:200 mg/3 mL。

样品制备

样品提取

称取烤鱼试样2 g置于50 mL离心管中,加入10 mL 40 g/L氢氧化钠︰甲醇=70︰30(V/V)混合溶液,均质1 min。均质器刀头分别用5 mL上述溶液各洗涤两次,洗涤液合并至样品提取离心管中。提取液在10000 r/min条件下离心10 min,待净化。

样品净化

将Cleanert® PS小柱依次用2 mL甲醇、3 mL 4 g/L氢氧化钠溶液活化平衡。量取10 mL提取液加入固相萃取主中,弃去流出液后,依次用3 mL 4 g/L氢氧化钠︰甲醇=45︰55(V/V)混合溶液、2 mL正己烷淋洗,每次淋洗完后都需将柱体内淋洗溶液抽干,最后用3 mL乙醇︰二氯甲烷=10︰90(V/V)混合溶液洗脱,洗脱流速小于1 mL/min。洗脱液于氮气浓缩至近干后,加入1 mL的10%乙腈水溶液复溶,涡旋混匀,过0.22 μm Nylon针式过滤器,待检测。

以上净化步骤可用卓睿全自动固相萃取仪完成。

实验条件

色谱条件

色谱柱:Venusil MP C18,3 µm,100 Å,3.0 × 50 mm;

流动相A:0.1%甲酸水溶液;

流动相B:0.1%甲酸乙腈溶液;

柱  温:40℃;

进样量:5 µL。

梯度洗脱条件(见表1)

表1. 液相色谱梯度洗脱条件

时间/min

流速/(mL/min)

A%

B%

0.0

0.2

90

10

0.5

0.2

90

10

5

0.2

95

5

7

0.2

95

5

7.01

0.2

90

10

17

0.2

90

10

质谱条件

离子源:ESI+;电喷雾电压:5500 V;雾化气压力:50 psi;气帘气压力:25 psi;辅助气压力:50 psi;离子源温度:500℃;采集方式:多反应监测(MRM)。

表2. 5种杂环胺类物质质谱参数

物质名称

Q1

Q3

DP/V

CE/V

MeIQ

213.1

197.9

103

36.9

198.7

36.3

MeIQx

214.0

198.8

98

37.0

130.8

52.3

4,8-DiMeIQx

228.0

213.0

109

35.2

159.6

40.2

7,8-DiMeIQx

228.0

213.1

97

36.2

130.9

52.2

PhIP

225.2

210.0

102

40.1

182.9

51.6

注:“下划线”为定量离子。

结果与讨论

由表3可知,采用SPE结合LC-MS/MS的方法检测烤鱼中5种杂环胺类物质,加标回收率在65% ~ 95%之间,且变异系数小于10%,能够满足检测要求。由图1 ~ 图4可知,用Venusil MP C18色谱柱检测5种杂环胺类,峰形良好,且保留时间稳定。

表3. 烤鱼中5种杂环胺类物质加标回收实验结果(添加水平0.01 mg/kg)

物质名称

保留时间/min

平均回收率/%

CV%

MeIQ

1.74

93.5

1.4

MeIQx

3.98

66.1

3.8

4,8-DiMeIQx

6.04

82.7

3.1

7,8-DiMeIQx

6.04

80.7

5.9

PhIP

6.57

72.4

3.0

图1. 0.01 µg/mL杂环胺类混合标准溶液LC-MS/MS色谱图

图2.烤鱼样品空白LC-MS/MS色谱图

图3. 0.01 µg/mL烤鱼基质混合标准溶液LC-MS/MS色谱图

图4. 0.01 mg/kg烤鱼基质加标LC-MS/MS色谱图

结论

本实验重现了GB5009.243-2016烤鱼中杂环胺类物质的前处理方法,并结合LC-MS/MS对样品进行了检测。结果表明,对于加标量为0.01 mg/kg的烤鱼样品,加标回收率在65% ~ 95%之间,满足检测要求,且变异系数小于10%,稳定性良好。说明该方法适用于烤鱼中5种杂环胺类物质的同时检测。

附:相关产品

产品名称

规格描述

包装数量

订货号

Cleanert® PS

200 mg/3 mL

30支/包

PS2003

12位固相萃取真空装置

12位

1台

VM12

卓睿全自动固相萃取仪

4通道,24位

1台

SPE-40

Venusil MP C18

3 µm,100 Å,3.0   × 50 mm

1支

VA930503-0

1.5 mL样品瓶

短螺纹透明带书写处

32   × 11.6 mm

100/pk

1109-0519

氮吹仪

15位

1台

NV15-G

1.5mL样品瓶盖

9 mm中心孔蓝盖,红色橡胶/米色PTFE隔垫45°Shore   A; 1.0 mm

100/pk

0915-1819

尼龙针式过滤器

单膜,13   mm,0.22 µm

200个/包

AS021320

一次性注射器

2   mL无针头

100支/包

LZSQ-2ML

应用编号:AF10163 


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